식중독 원인조사

세균 검사 방법

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)

황색포도상구균 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양
  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여 225mL의 10% NaCl 첨가한 TSB 배지에 가한 후
  • 35~37℃에서 18~24시간 증균배양
분리배양
  • 증균배양액을 난황첨가 만니톨 식염한천배지 또는 Baird-Parker 한천배지에 접종
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양(황색불투명 집락 확인)
* baird-parker medium황색포도상구균 baird-parker medium 세균 샘플사진
확인시험
  • 분리배양된 평판배지상의 집락을 보통 한천배지에 옮김
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양
  • 그람염색을 실시하여 포도상의 배열을 갖는 그람양성 구균 확인 후 coagulase 시험을 실시(24시간 이내에 응고 유무 판정) ※ Baird-Parker 한천배지에서 전형적인 집락으로 확인된 것은 coagulase 시험을 생략할 수 있음
  • Coagulase 양성으로 확인된 것은 생화학 시험을 실시하여 판정
* coagulase test황색포도상구균 coagulase test
* blood agar황색포도상구균 blood agar
* api kit 결과 확인
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살모넬라균(Salmonella spp.)

살모넬라균 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양
  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여 225mL의 펩톤수에 가한 후
  • 35~37℃에서 24±2시간 증균배양 배양액 0.1mL 취하여 10mL의 Rappaport-Vassiliadis 배지에 접종
  • 42±1℃에서 24±2시간 배양
살모넬라균 증균배양
분리배양
  • 증균배양액을 MacConkey 한천배지 또는 Desoxycholate 한천배지 또는 XLD 한천배지 또는 Bismuth Sulfite 한천배지에 접종
  • 35~37℃에서 24±2시간 배양 후 전형적인 집락은 확인시험 실시
* macconkey agar
살모넬라균 macconkey agar
* ss agar살모넬라균 ss agar
* xld agar살모넬라균 xld agar
확인시험

(생화학적 확인시험)

  • 분리배양된 평판배지상의 집락을 보통한천배지에 옮김
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양
  • TSI 사면배지의 사면과 고층부에 접종
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양하여 생물학적 성상을 검사 ※살모넬라는 유당, 서당 비분해(사면부 적색), 가스생성(균열 확인) 양성인 균에 대하여 그람음성 간균, urease 음성, Lysine decarboxylase 양성 등의 특성이 확인되면 살모넬라 양성으로 판정

(응집시험)

  • 균종 확인이 필요한 경우 Spicer-Edwards 등과 같은 H혼합혈청과 O혼합혈청을 사용하여 응집반응을 확인
* glucose분해, lactose, sucrose 비분해, 가스생성, h2s 생성
살모넬라균 확인시험
* api kit 결과 확인
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* 응집시험 결과 확인살모넬라균 혈청시험 결과

대장균 O157L:H7(Escherichia coli O157:H7)

대장균 O157L:H7 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양
  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여 225mL의 mTSB 배지에 가한 후
  • 35~37℃에서 24±2시간 증균배양
분리배양
  • 증균배양액을 CT-SMAC과 BCIG 한천배지에 각각 접종
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양
  • Sorbitol을 분해하지 않는 무색집락을 취하여 EMB 한천배지에 접종
  • 35~37℃에서 24±2시간 배양
  • 녹색의 금속성 광택이 확인된 집락은 확인시험을 실시
* macconkey sorbitol agar대장균 O157:h7 macconkey sorbitol agar
* emb 확인 대장균 O157:h7 emb 확인
확인시험
  • EMB 한천배지에서 녹색의 금속성 광택을 보이는 집락을 보통 한천배지에 옮김
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양
  • 그람음성간균임을 확인하고 생화학시험을 실시
* api kit 결과 확인
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혈청형시험
  • 대장균으로 확인 동정된 균은 O157 항혈청을 사용하여 혈청형을 결정하고, O157이 확인된 균은 H7의 혈청형 시험을 실시
대장균 혈청시험 결과

장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus)

장염비브리오균 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양
  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여 225mL의 Alkaline 펩톤수를 가한 후
  • 35~37℃에서 18~24시간 증균배양
분리배양
  • 증균배양액을 TCBS 한천배지에 접종
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양
  • 배양결과 직경 2~4mm인 청록색의 서당 비분해 집락에 대하여 확인시험을 실시
* tcbs agar
장염비브리오균 tcbs agar
확인시험
  • 분리배양된 평판배지상의 집락을 TSI 사면배지, LIM 반유동배지, 보통한천배지에 각각 접종
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양 ※ 장염비브리오는 TSI 사면배지에서 사면부가 적색, 고층부는 황색, 가스가 생성되지 않으며 LIM 배지에서 Lysine Decarboxylase 양성, Indole 생성, 운동성 양성, Oxidase 시험 양성
  • 장염비브리오로 추정된 균은 0, 3, 8 및 10% NaCl을 가한 Alkaline 펩톤수에 의한 내염성 시험, VP 시험, Mannitol 이용성시험(1% Mannitol 첨가), Arginine 및 Ornithine 분해시험(1% Arginine 또는 1% Ornithine 첨가), ONPG 시험을 실시 ※ 장염비브리오는 0% 및 10% NaCl 가한 배지에서 발육음성, 3% 및 8% NaCl을 가한 배지에서는 발육양성, VP음성, 만니톨에서 산생성 양성, Ornithine 분해 양성, Arginine 분해 음성, ONGP 시험음성, 3% NaCl을 가한 Nutrient Broth, 42%에서 발육 양성
* 사면부 적색, 고층부 황색, 가스 및 황화수소 비생성
장염비브리오균 확인시험
* api kit 결과 확인
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바실러스 세레우스균(Bacillus cereus)

바실러스 세레우스균 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
분리배양
  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여 225mL의 희석액을 가하여 균질화한 검액을 MYP 한천배지에 접종
  • 30℃에서 24시간 배양
  • 배양후 혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락을 선별(이 때 명확하지 않을 경우 24시간 더 배양하여 관찰)
* mypl agar
바실러스균 mypl agar
확인시험
  • MYP 한천배지에서 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지에 접종
  • 30℃에서 18~24시간 배양
  • 배양 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성 간균을 확인
  • 확인된 균은 nitrate 환원능, VP, β-hemolysis, tyrosine분해능, 혐기배양시의 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시
  • 추가로 24~48시간 배양하여 곤충독소단백질(Insecticidalcrystal protein)생성 확인시험주)도 실시
    주)이 시험법은 Bacillus cereus와 Bacillus thuringiensis를 구분하는 시험법으로, 보통한천배지에 30℃, 24~48시간 배양한 후 직접 또는 염색하여 현미경 관찰결과(×1000배), 곤충독소단백질이 확인되면 Bacillus thuringiensis로 한다.

캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)

캠필로박터 제주니 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양
  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여supplement A가 첨가된 HUNT 배지 또는 Bolton 배지 100mL에 넣고 균질화
  • 35~37℃에서4~5시간 미호기적(5% O2 10% CO2, 85% N2으로 1차 증균
  • 42℃에서 24~48시간 미호기적으로 2차 증균
  • pre-enrichment (4hr, 37℃) ※ 다만, HUNT 배지를 사용할 경우, 일반식품은 2차 증균시 cefoperazone 용액(0.8g/100mL) 0.4mL를 첨가하고 유제품은 1차 증균시 supplement B, 2차 증균시에는 rifampicin 용액(0.125g/100mL) 0.4mL를 첨가하여 배양한다.
분리배양
  • 증균배양액을 modified Campy blood free 한천배지 또는 Abeyta-Hunt 한천배지 또는 Preston 한천배지 또는 CCA 한천배지 또는 BCA 한천배지에 접종
  • 42℃에서 24~48시간 미호기적으로 암소에서 배양
확인시험
  • Modified Campy blood free 한천배지상에서 원형 또는 불규칙한 형태로서 반투명한 흰색 또는 투명한 집락, Abeyta-Hunt 한천배지상에서 무지개빛 광택 집락을 선별하여 항생제를 넣지 않은 Abeyta-Hunt 한천배지에 신속히 접종
  • 42℃에서 24~48시간 배양
  • 배양된 집락을 취하여, 암시야 또는 위상차현미경으로 검경하거나 또는 대비 염색하여 지그재그 모양을 관찰한다. (이 때 대비염색은 10mL 식염수에 2방울의 crystal violet을 혼합한 용액을 이용
  • 현미경상으로 확인된 균에 대하여 catalase 및 oxidase 양성임을 확인
  • 확인된 균에 대하여 hippurate 분해 양성, 황화수소 비생성, nalidixic acid 감수성, cephalothin 내성, 25℃에서 비생육, 42℃에서 생육하는 것 등 생화학시험을 실시

리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytgenes)

리스테리아 모노사이토제네스 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양

(우유, 유제품, 가공식품 및 수산물의 검체에 대해서는 증균배지로 Listeria 증균배지를 사용)

  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여 225mL의 Listeria 증균배지를 가한 후
  • 30℃에서 48시간 배양

(우유, 유제품, 가공식품 및 수산물의 검체에 대해서는 증균배지로 Listeria 증균배지를 사용)

  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여 UVM-modiried Listeria 증균배지를 225mL 가한 후
  • 30℃에서 24±2시간 배양
  • 배양액 0.1mL를 취하여 Fraser Listeria 배지 10mL에 접종
  • 35~37℃에서 24±2시간 2차 증균을 실시
리스테리아 모노사이토제네스 증균배양
분리배양
  • 증균배양액을 멸균된 면봉을 이용하여 Oxford 한천배지 또는 LPM 한천배지 또는 PALCAM 한천배지에 접종
  • 30℃에서 24~48시간 배양
  • 의심집락이 확인되면 이를 0.6% yest extract가 포함된 Tryptic soy 한천배지에 접종
  • 30℃에서 24~48시간 배양
* oxford agar
리스테리아 모노사이토제네스 oxford agar
확인시험
  • 그람염색 후 그람양성 간균이 확인되면 hemolysis, motility, catalase, CAMP test와 mannitol, rhamnose, xylose의 당분해 시험을 실시
  • 이 결과 β-hemolysis를 나타내고 catalase 양성, motility 양성을 아타내며 CAMP test 결과 Staphylococcusaureus에서 양성, Rhodococcus equi에서 음성으로 나타나는 동시에 당분해시험 결과 mannitol 비분해, rhamnose 분해, xylose 비분해의 결과를 보일 경우 Listeria monocytogenes 양성으로 판정
* camp test
리스테리아 모노사이토제네스 camp test
* motility 결과
리스테리아 모노사이토제네스 motility 결과1
리스테리아 모노사이토제네스 motility 결과2 리스테리아 모노사이토제네스 motility 결과3
* api kit 결과 확인
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여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)

여시니아 엔테로콜리티카 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양
  • 검체 25g 또는 25mL를 취하여 225mL의 PSBB 배지에 가한 후
  • 10℃에서 10일간 배양
분리배양
  • 증균배양액 0.1mL를 0.5% KOH가 함유된 0.5% 식염수 1mL에 가하여 수초간 섞는다.
  • 이 용액을 MacConkey 한천배지와 CIN 한천배지에 각각 접종
  • 30℃에서 24±2시간 배양
* macconkey agar
작은 반투명 볼록 회백색 집락
여시니아 엔테로콜리티카 macconkey agar : 작은 반투명 볼록 회백색 집락
확인시험
  • MacConkey 한천배지에서 유당을 비분해하는 집락이나 CIN 한천배지에서 중심부가 짙은 적색을 보이는 집락을 골라 각각 TSI 사면배지의 사면과 고층부에 접종
  • 35~37℃에서 18~24시간 배양
  • 고층부와 사면이 노랗고 가스와 황하수소가 발생하지 않은 균주를 선택
  • 25℃, 37℃에서 운동성 시험 및 urea, citrate 시험 등을 실시
    ※ 이 때 여시니아 엔테로콜리티카는 37℃에서는 운동성을 나타내지 않고 25℃에서 운동성을 가지는 특성이 있다. 또란 urea 시험 양성, citrate 시험 음성이며 그람음성 간균일 때 양성으로 판정

클로스트리움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

클로스트리움 퍼프린젠스 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양
  • 식품공전 10.일반시험법의 3.미생물실험법중 3.3제조법에 따른 시험용액 1mL를 Cooked Meat 배지의 아랫부분에 접종
  • 35~37℃에서 18~24시간 동안 혐기배양
분리배양
  • 카나마이신을 200㎍/mL의 농도로 가한 난황 첨가
  • Clostridium perfringens 한천배지 또는 난황첨가 TSC 한천배지에 증균배양액을 접종
  • 35~37℃에서 18~24시간 혐기배양
  • Clostridium perfringens 한천배지에서 직경 2mm 정도의 약간 돌기된 유황색으로 주변에 불투명한 백색환이 있는 집락 또는 TSC 한천배지에서 불투명한 환을 가지는 황회색 집락은 확인시험을 실시
확인시험
  • 분리배양된 평판배지상의 집락을 보통한천배지에 옮긴다.
  • 35~37℃에서 18~24시간 혐기배양한 후 그람염색 실시
  • 동시에 보통한천배지를 35~37℃에서 18~24시간 호기 배양하여 균의 비발육을 확인
  • 그람양성간균으로 확인된 집락은 glucose, lactose, inositol, raffinose를 1% 가한 4종의 GAM 배지에 옮긴다.
  • 35~37℃에서 3일간 배양 후 BTB-MR 지시약을 가해서 붉은 색으로 편하는 것을 양성으로 판정
  • 운동성은 GAM 배지에서 35~37℃에서 1~2일간 배양하여 운동성의 유무를 관찰
  • Glucose, lactose, inositol과 raffinose를 분해하며 운동성이 없는 것을 확인하면 Lecithinase 억제 시험을 실시
  • 난황이 포함된 TSC 한천배지에 접종하여 35~37℃에서 24시간 혐기배양한 수 2~4mm 불투명한 환을 가지는 황회색 집락을 양성으로 판정

클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum)

클로스트리움 보툴리늄 검사방법
시험목적 시험법 확인법(실험예)
증균배양
  • 고형 또는 반고형물 검체는 동량의 젤라틴 인산완충액을 첨가하고 균질화하여 시험용액으로 하며, 액상 검체는 그대로 사용
  • 1~2g 또는 1~2mL의 검체를 2개의 Cooked Meat 배지 15mL에 접종
  • 35~37℃에서 7일간 배양
    ※ 다만, 접종 전 각 배지는 10~15분간 중탕하여 탈사소한 후 신속히 냉각하여 사용하며, 검체는 배지 아래부분에 천천히 접종하고 교반하지 않는다.
  • 배양 7일 후 검경하여 전형적인 클로스트리디움이 관찰되면 다음의 분리배양을 실시하고, 관찰되지 않는 경우에는 추가적으로 10일간 더 배양한다.
분리배양
  • 증균배양액 1~2mL와 동량의 여과 제균한 알코올을 잘 혼합하여 실온에서 1시간 방치
  • Liver-Veal 난황한천배지 또는 혐기성 난황한천배지에 접종
  • 35~37℃에서 48±3시간 혐기적으로 배양
  • 배양 후 융기되거나 평평하며, 표면이 매끈하거나 거친 집락으로, 약간 퍼져 있거나 불규칙한 것을 선택하여 약 10개를 취한다. 경우에 따라서는 집락 주위에 혼탁한 환이 생긴다.
확인시험
  • 분리균에 대하여 Gram 양성의 간균과 균체 말단에 아포가 형성되는 것을 관찰하고, 호기조건으로 35~37℃에서 2~3일간 배양하였을 경우 균이 발육되지 않는 것을 확인
  • 0.1%의 glucose를 첨가한 GAM 배지에 접종하여 35~37℃에서 1~4일간 배양하여 운동성이 있는 것을 양성으로 판정
  • 질산염환원능이 없으므로 glucose 0.1% KNO3 0.3%를 가한 GAM 배지에 접종하여 35~37℃에서 2일간 배양 후 Nitrite 지시약을 가하였을 경우 색의 변화가 없어야 한다.
  • 우유를 pH 6.8되도록 조정하여, FeSO4 0.05~0.1g을 첨가한 배지에 균을 접종하여 35~37℃에서 배양한 후 우유를 분해하는 것을 양성으로 판정